МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ ОСТРОЙ ДЕКОМПЕНСИРОВАНЫЙ  ОБТУРАЦИОННОЙ  НЕПРОХОДИМОСТИ В УСЛОВИЯХ ИНТРАОПЕРАЦИОННОГО ЛАВАЖА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

¹В.Р. Арутюнян,  ²А.Э.  Али-Риза,  ³А.М. Сухоруков, А.А.Поздняков, О.И.Хабарова 

¹Кафедра и клиника хирургических болезней им. проф. А.М. Дыхно

с курсом эндоскопии и эндохирургии ПО (зав. – проф. Д.А. Черданцев);

²Кафедра патологической анатомии с курсом ПО им. проф. П.Г. Подзолкова (зав. – проф. А.К. Кириченко) ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно–Ясенецкого, г. Красноярск; ³ФГБНУ «НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН», г. Красноярск

ХГУ им.Н.Ф.Катанова

Ключевые слова: экспериментальная острая декомпенсированная толстокишечная непроходимость, лаваж толстой кишки.

Разработана   методика лаважа при  экспериментальной острой толстокишечной непроходимости с использованием Устройства "Гейзер". Проведен комплексный  морфометрический  анализ стенки толстой кишки, Результаты морфологических исследований сопоставлены с микробиологическим исследованием промывных вод у  экспериментальных животных в условиях декомпенсированной обтурационной толстокишечной непроходимости.

Лечение обтурационной толстокишечной непроходимости остается актуальной проблемой современной хирургии. Это обусловлено ростом числа злокачественных новообразований ободочной и прямой кишки [1].

          Повышение внутрикишечного давления на фоне острой кишечной непроходимости последовательно ведет к нарушениям микроциркуляции в стенке кишки с ее ишемией и  прогрессированием эндотоксической  реакции вследствие абсорбции скапливающихся в просвете кишки продуктов распада. Вследствие этого, декомпрессия кишки с эвакуацией ее содержимого и лаваж просвета кишки являются одним из важнейших этапов лечения больных кишечной непроходимостью [4]. Одним из важных факторов, влияющих на течение послеоперационного периода и развитие осложнений, следует считать бактериальную транслокацию патогенных микроорганизмов из просвета кишки.

Цель настоящего исследования -  дать   комплексную  микробиологическую оценку  промывных вод у  экспериментальных животных с декомпенсированной обтурационной толстокишечной непроходимостью, сопоставить её с морфологической картиной стенки кишки при длительной (декомпенсированной – 48 часов) ОТКН.

Материал и методы

Моделирование  декомпенсированной ОТКН  проводилось путем ушивания ануса у экспериментальных животных на период 48 часов у 50 беспородных кроликов. Подтверждением  развития декомпенсированной непроходимости являлся гастростаз, подтвержденный рентгенологически. Все кролики с ОТКН были  разделены на 5 серий - по 10 кроликов в каждой. Через 48 часов с момента создания модели лигатуры снимали,  выполнялась лапаротомия под общим наркозом, а  в просвет толстой кишки заводился резиновый катетер и проводилось отмывание  толстой кишки от токсичного содержимого.  Использовали  солевые растворы разной осмотической активности в количестве 250 мл на 1кг массы животного: в первой серии - 10 кроликов без лаважа толстой кишки; 2 серия - лаваж раствором с осмолярностью 300 мосм/л; 3 серия - с раствором  осмолярностью 360 мосм/л; 4 серия - с раствором  осмолярностью 450 мосм/л и 5 серия - лаваж раствором с осмолярностью 540 мосм/л.   Заборы  на микрофлору проводили в стерильные пробирки из первых проб кишечного содержимого и из  последней пробы промывного раствора.

Через 1 час после отмывания просвета толстой кишки    орган забирался на  морфологическое и морфометрическое исследование.  

Методика бактериологического исследования: после забора материал доставлялся в лабораторию в течение двух часов в термобиксе.  Из него готовилось первичное разведение в 10^-1. Из последнего проводили дальнейшие разведения до 10^-10. Из разведения 10^-1 проводился посев на хлор-магниевую среду в количестве 1 мл для накопления патогенной микрофлоры. Так же проводился посев на среды «Эндо» и «Азидная» в количестве 0,05 мл с последующим растиранием шпателем. Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ) проводили посев глубинным методом, где брали 1 мл материала из каждого разведения и вносили в стерильные чашки Петри, затем заливали МПА при температуре 45°С. Все питательные среды подвергали инкубации при температуре 37 ^оС: на средах «Эндо», МПА, хлор-магниевой 24 часа, на «Азидной» – 48 часов. С хлор-магниевой среды проводили посев петлей на висмут-сульфитный агар, который подвергали инкубации при температуре 37^оС в течении 48 часов. Далее со сред отбирались колонии, схожие по культуральным свойствам, после чего каждой колонии присваивался номер и производился пересев на скошенный мясо-пептонный агар, который подвергался инкубации при температуре 37^оС в течение 24 часа, из данной культуры проводились дальнейшие исследования. С культур выросших на средах, делались мазки со всех колоний и окрашивались по Грамму, затем подвергали микроскопии.

 Материал для гистологического исследования готовился по стандартной методике. Фрагменты толстой кишки фиксировали в 10% растворе нейтрального, забуференного формалина. Обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, выдерживали в ксилоле и заключали в парафин. На роторном микротоме «Leica» из каждого фрагмента толстой кишки приготавливали ступенчатые срезы толщиной 5-6 мкм, 5-6 из которых окрашивали гематоксилином Маейера и эозином, по методу Ван-Гизона пикрофуксином, по методу Крейберга на слизь. Светооптическое исследование и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе “Axiostar” (Германия) при увеличении (х100 и х400). Для определения количественных показателей патологического процесса использовали морфометрию. Морфометрическое исследование микропрепаратов толстой кишки проводилось при помощи программы «Image J 1.48 v». В   каждом образце ткани   производилось измерение определенных параметров в 10 полях зрения с последующим вычислением средней арифметической (вычисление среднего значения проводилось на основании приближенности морфометрических параметров каждого случая к нормальному распределению). Для количественной  оценки патоморфологических изменений в толстой кишке определяли следующие параметры:  - толщину  стенки кишки (мм);  -отношение толщины стенки  кишки к толщине её слизистой оболочки (мм); - определение численной плотности клеток внеклеточного матрикса слизистой оболочки (689х516,2 мкм). Степень  выраженности отека всей стенки кишки и её слизистой оболочки определяли полуколичественным методом по 3-м степеням.

Результаты и их обсуждение .

При декомпенсированной  (48 часов) ОТКН гистологическая картина  толстой кишки были следующей: в слизистой оболочке отмечали выраженный отек внеклеточного матрикса наряду с значительной диффузной лейкоцитарной и лимфоплазмоцитарной инфильтрацией. В поверхностных отделах слизистой оболочки в зонах некрозов наблюдали формирование единичных эрозий и крипт-абсцессов. При окраске на слизь отмечалось неравномерное окрашивание эпителиоцитов крипт и малочисленное окрашивание эпителиоцитов поверхностного эпителия. Подслизистая оболочка значительно отечная, слабо и неравномерно инфильтрирована сегментоядерными лейкоцитами и плазматическими клетками. Гладкие миоциты в мышечной оболочке расположены компактно, формируют два слоя: поперечный и продольный. Отмечается слабо выраженный отек внеклеточного матрикса мышечной оболочки. Кровеносные сосуды всех оболочек умеренного кровенаполнения.  Имеется слабо выраженный отек серозной оболочки (Рис. 1а).

В группе животных с моделью 48- часовой ОТКН    и лаважом толстой кишки раствором 300 мосм/л микроскопическое исследование показало, что в слизистой оболочке отмечается умеренно выраженный отек внеклеточного матрикса в сочетании с умеренно выраженной инфильтрацией сегментоядерными лейкоцитами и плазматическими клетками равномерного характера. Выявляли малочисленные лимфоидные фолликулы, представленные зрелыми лимфоцитами. Структура эпителиоцитов слизистой оболочки была сохранена. Среди  эпителиоцитов преобладали бокаловидные клетки.  При окраске на слизь отмечали резко положительное окрашивание апикальных концов эпителиоцитов крипт, при этом со стороны поверхностного эпителия положительно окрашиваются единичные клетки. Подслизистая оболочка  была с морфологическими признаками выраженного отека,  умеренной диссоциацией волокон, слабой плазмоцитарной инфильтрацией. Гладкомышечные клетки располагались компактно. Просветы сосудов слизистой, подслизистой и мышечной оболочек были,  в большинстве своем, запустевшими. Серозная оболочка имела морфологические признаки слабо выраженного отека. Клеточный компонент  был представлен вытянутыми клетками со скудной цитоплазмой (рис.1б).

В группе животных с моделью 48- часовой ОТКН   (лаваж раствором 360 мосм/л) микроскопическое исследование показало, что  в слизистой оболочке толстой кишки отмечался слабо выраженный отек внеклеточного матрикса в сочетании со слабо выраженной инфильтрацией сегментоядерными лейкоцитами и макрофагами, особенно в её базальных отделах. Общая структура эпителиоцитов слизистой оболочки была сохранена, а при окраске на слизь отмечали  положительное окрашивание апикальных концов эпителиоцитов крипт.  Подслизистая оболочка была слабо отечная, представлена компактно расположенными волокнами. Гладкие миоциты в мышечной оболочке были  расположены тоже компактно, формируя два слоя. Сосуды слизистой, подслизистой и мышечной оболочек были малокровны, с запустевшими просветами. Серозная оболочка была  слабо отечная, клеточный компонент был представлен вытянутыми клетками со скудной цитоплазмой. Брыжейка была с признаками слабо выраженного отека, соединительнотканный компонент был скуден, воспалительная клеточная инфильтрация не определялась (рис.1в).

У кроликов   после моделирования 48 часовой ОТКН   и лаважа раствором 450 мосм/л  при микроскопическом исследовании были выявлены следующие морфологические изменения: общая структура эпителиоцитов слизистой оболочки была сохранена, отмечали слабый отек внеклеточного матрикса в сочетании со слабо выраженной инфильтрацией сегментоядерными лейкоцитами и макрофагами в базальных отделах собственной пластинки слизистой оболочки. Среди эпителиоцитов преобладают бокаловидные клетки.  При окраске на слизь отмечается  положительное окрашивание апикальных концов эпителиоцитов крипт, при этом со стороны поверхностного эпителия положительно окрашиваются единичные клетки. Подслизистая оболочка слабо отечная, представлена компактно расположенными волокнами. Гладкие миоциты в мышечной оболочке расположены компактно, формируют поперечный и продольный слои. Отмечали слабое кровенаполнение  сосудов слизистой, подслизистой и мышечной оболочек. Серозная оболочка выглядела слабо отечной, клеточный компонент был представлен вытянутыми клетками со скудной цитоплазмой. Прилегающая брыжейка была с морфологическими признаками умеренного отека, соединительнотканный компонент был скуден, воспалительная клеточная инфильтрация не определялась (рис.1г).

В группе 5 животных после моделирования 48 часовой ОТКН   (лаваж раствором 540 мосм/л) микроскопическое исследование показало, что со стороны внеклеточного матрикса собственной пластинки слизистой отмечается выраженный отек, а также выраженная и равномерная инфильтрация сегментоядерными лейкоцитами и плазматическими клетками. При окраске на слизь отмечали резко положительное и неравномерное окрашивание апикальных концов эпителиоцитов крипт, при этом со стороны поверхностного эпителия положительно окрашиваются единичные клетки. Подслизистая оболочка была резко отечная, с дискомплексацией волокнистых структур. Отмечалась  выраженная воспалительная клеточная инфильтрация подслизистой оболочки сегментоядерными лейкоцитами, лимфоцитами и плазматическими клетками. Внеклеточный матрикс мышечной оболочки был отечен, неравномерно и умеренно инфильтрирован сегментоядерными лейкоцитами и плазматическими клетками. Гладкие миоциты мышечной оболочки были организованы соответствующим образом, формируя  два слоя – поперечный и продольный. Отмечали  слабо выраженную воспалительную инфильтрацию  и умеренно выраженный отек серозной оболочки. Кровеносные сосуды слизистой оболочки  были полнокровны, в остальных слоях стенки кишки отмечалось умеренное кровенаполнение сосудов (рис. 1д).

 Кролик, толстая кишка после моделирования 48 часовой ОТКН

Рис. 1. Кролик, толстая кишка  после моделирования 48 часовой ОТКН. 

а – без санации (ОТКН ликвидирована); б – санация раствором 300 мосм/л; в - санация раствором 360 мосм/л; г - санация раствором 450 мосм/л; д- санация раствором 540 мосм/л; Окраска Г-Э. Ув. x 40 - а б, в, г;  Ув. х 200 - д.

При подсчете морфометрических параметров воспалительного процесса в толстой кишке у кроликов   при  48-часовой ОТКН  (непосредственно после лаважа), получены следующие значения, которые  представлены в таблице 1.

Таблица 1

Динамика морфометрических  показателей  толстой кишки у кроликов   при  48-часовой ОТКН.

 (непосредственно после лаважа толстой кишки)

р – сравнение с предыдущим результатом

P – сравнение с контролем

При анализе динамики  количественных морфометрических  показателей толстой кишки у кроликов  с ОТКН (непосредственно после лаважа) выяснилось, что развитие декомпенсированной  непроходимости  приводило к достоверному увеличению   отека слизистой оболочки толстой кишки, увеличению численной плотности воспалительного клеточного инфильтрата, и,  как следствие, увеличению общей толщины стенки толстой кишки (табл.1). Динамика значений показателей данной таблицы отражают прогрессирующее нарастание воспалительной клеточной реакции в процессе изменения давности ОТКН. 

При сроках экспериментальной ОТКН 48 часов  (через 60 минут после лаважа) при санация 300мосм/л  выявлена тенденция к уменьшению плотности клеточной инфильтрации слизистой оболочки (по сравнению с  контролем на 8,9%, Р>0,05), а при санация 360 мосм/л  - значения показателя сокращались (по сравнению с  контролем) в 1,9раза (P<0,01, p<0,01). При осмолярности раствора 450 мосм/л плотность клеточной инфильтрации уменьшалась (по сравнению с контролем) в 2,48 раза, а  при осмолярности 540 мосм/л  - уменьшалась   только в 1,34раза.

Оценка степени отека слизистой оболочки толстой кишки  при 48 часовой ОТНК составила максимальное значение - 3,0 балла;  при санации растворами с разной осмотической активностью, отек уменьшался в неодинаковой степени: при этом  наилучшим  был раствор с осмолярностью  450 мосм/л,  а максимальная оценка степени отека слизистой оболочки кишки уменьшалась до 1,6±0,5 балла (P<0,01 и p<0,05).

При  лаваже раствором с осмолярностью  450   мосм/л морфометрические показатели толщины стенки толстой кишки выражались как 702,0±79,9 мкм (P<0,01), а в контрольной группе  составили 904,9±81,0 мкм. Толщина слизистой оболочки толстой кишки в контроле составила  234,4±78,8мкм; при санации раствором с осмолярностью  450мосм/л её толщина была  - 373,2±80,3 мкм,  (P<0,05). Соотношение толщины стенки кишки к толщине слизистой оболочки имело следующую динамику: в контрольной группе (ОТНК 48 часов) оно составило 4,2±1,3, а наилучшими значениями  данного соотношения были при санации раствором с осмолярностью  450 мосм/л  и составило 1,9±0,4(P<0,01).

Динамика показателей микрофлоры толстой кишки при  её лаваже.    

     При анализе изменений показателей микрофлоры содержимого толстой кишки в динамике экспериментальной  декомпенсированной ОТКН отражены в.табл.1 и табл.2: отмечается значительный количественный прирост всех представителей микрофлоры до предельных значений (до10* 8-12 порядка). При такой концентрации микроорганизмов в просвете кишки и  на фоне увеличивающейся зоны нарушений  микроциркуляции в её стенке и при появлении некрозов слизистой оболочки создаются условия для массивной транслокации микробов и развития воспалительной инфильтрации в стенке кишки.

    Как следует из таблицы 2, максимальное снижение концентрации микроорганизмов в последних порциях промывного раствора  отмечено с раствором  осмолярностью 540 мосм/л. ( т.е. на 7-8 порядков, в сравнении с уровнем микробов в кишечном содержимом перед лаважом).  Следует отметить, что наиболее значительным было содержание микрофлоры в последних порциях растворов с осмолярностью 300 мосм/л (снижение  только на 2-3 порядка), а самым низким – при  лаваже 540 мосм/л (снижение на 6-8 порядков). Возможно, что чем выше концентрация микрофлоры в кишечном содержимом (при продолжительной экспозиции ОТКН), тем выше должна быть осмолярность промывного раствора. Однако значения осмотической активности раствора, применяемого для лаважа кишки, не должны быть таковыми, чтобы не вызывать  дополнительные повреждения в  её стенке. Таким образом, важны не только осмолярность раствора, но и степень его влияния на морфологическую картину толстой кишки после ликвидации ОТКН.

                                                                                           Таблица №2

Уровень бактериологических показателей (loqМЧ) в заключительных                                                                                  

пробах промывного раствора  у животных с 48- часовой ОТКН

   р — сравнение с предыдущим результатом

    Р — сравнение с контролем

Таким образом, проведение интраоперационного лаважа толстой кишки  при декомпенсированной ОТНК сопровождается значительным снижением внутрипросветного уровня микрофлоры   и  снижением воспалительной реакции в стенке кишки.

Выводы:1. Моделирование декомпенсированной ОТКН сопровождается резким возрастанием массы микрофлоры в толстой кишке на фоне некробиотических и воспалительных процессов в стенке кишки.

2. Лаваж толстой кишки приводит к значительному снижению бактериального присутствия в просвете кишки и  снижению  активности воспалительного процесса в её стенке.

3.Осмолярность промывного раствора является существенным фактором влияющим на степень снижения уровня микрофлоры при проведении лаважа толстой кишки.  При увеличении осмолярности раствора прогрессивно снижается масса микрофлоры, однако степень снижения воспалительного процесса в стенке кишки не имело линейной зависимости.

Библиографический список

1. Алиев, С. А.  Хирургическая тактика при обтурационной опухолевой непроходимости ободочной кишки у больных с повышенным операционным риском /  С. А. Алиев, А. А. Ашраф // Вестн. хирургии им. И. И. Грекова. – 1997. – № 1. – С. 46–49.
2. Александров, Н. А. Неотложная хирургия при раке толстой кишки / Н. А. Александров, М. И. Лыткин, В. П. Петров. – Минск : Беларусь, 1980. –170 c.
3. Важенин, А. В. Результаты лечения больных с опухолевой толстокишечной непроходимостью / А. В. Важенин, Д. О. Маханьков, С. Ю. Сидельников // Хирургия. – 2007. – № 4. – С. 49–53.
4. Штрапов, А. А. Энтеральная дезинтоксикация у больных с перитонитом и кишечной непроходимостью / А. А. Штрапов, Н. В. Рухляда // Вестн. хирургии им. И. И. Грекова. – 1986. – № 5. – С. 32–34.
5. Федоров, В. Д. Клиническая оперативная колопроктология: Руководство для врачей / В. Д. Федоров, Г. И. Воробьев, В. Л. Ривкин. – М. : ГНЦ проктологии, 1994. – 432 с.
6. Boyle, N. H. Intraoperative assessment of colonic perfusion using scanning laser flowmetry during colonic resection / N. H. Boyle, D. Manifold, M. H. Jordan // J. Am. Coll. Surg. – 2000. – Vol. 191, № 5. – P. 504–510.